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本试剂盒是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time qRT-PCR可在同一反应管内连续进行。反应过程中无需打开管盖添加试剂并可对扩增产物进行实时检测，避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。非常适合于微量RNA尤其是微量RNA病毒的检测。

本试剂盒包括最适合Real-Time PCR的突变改造逆转录酶HotScript M-MuLV RTase、热启动Taq DNA聚合酶和RNasin、同时包含适用于逆转录和PCR扩增的优化独特反应体系。

HotScript M-MuLV反转录酶的RNase H活性缺失，与M-MuLV相比，具有更强的延伸能力和稳定性。同时该酶多点突变提高了耐热性，可以在50℃反转录，提高了复杂二级结构，GC含量丰富模板反转录效率。

本试剂盒采用优质热启动Taq DNA聚合酶可以最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。

本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。

• 适用于高拷贝、低拷贝基因检测；
  
• 部分高GC含量或具有复杂二级结构的RNA模板。

• 当同时需要进行数次Real-Time One-Step qRT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。
  
• 使用Enzyme Mix和HotScript M-MuLV RTase时，分取之前要小心地瞬间离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有高浓度的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
  
• 2×qRT-PCR Mix内含SYBE Green I，保存或配制One-Step qRT-PCR反应液时应避免强光照射。
  
• 本制品不含Rox Reference Dye，部分需要用Rox染料校准孔间差异的荧光定量PCR仪器可另外选购Rox Reference Dye。
  
• 为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板。
  
• 不同的片段，所需最佳RNA模板用量不同，过多的RNA会抑制反应，建议根据反应调整模板用量。
  
• 只能使用特异性引物，不能使用Oligo(dT)和Random Primer进行反应。

• 根据下表冰上配制反应体系（以25μL/50μL举例）
  

  成分	20μL	50μL	终浓度
  2×qRT-PCR Mix	12.5μL	25μL	1×
  Forward Primer(10μM)	0.5μL	1μL	0.2μM
  Reverse Primer(10μM)	0.5μL	1μL	0.2μM
  Enzyme Mix	0.5μL	1μL	-
  HotScript M-MuLV RTase	0.5μL	1μL	-
  RNA template	X μl	X μL	1ng～1μg
  RNase free H2O	至25μL	至50μL	-

  • 引物浓度请以终浓度0.2～0.6μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
• 将配制好的反应体系混匀、离心后。
  
• 将PCR仪器预热到50℃，将PCR管置于荧光定量PCR热循环仪中，按以下扩增程序进行反应。
  

  步骤	温度	时间	循环数
  1	50℃	20～30分钟	1
  2	94℃	2～3分钟	1
  3	94℃	20秒	35-40
  	55～60℃	20秒
  	72℃	20秒
  4	根据需要加入融链曲线分析

  • 如果所采用的荧光定量PCR仪器没有特殊的要求，建议采用上述图表显示的标准的三步法PCR反应程序，如果使用该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化，例如采用两步法进行扩增可以减少非特异扩增，增强扩增的特异性。
• 实验结果分析：反应结束后确认One-Step qRT-PCR的扩增曲线和融解曲线，进行RT-PCR定量时制作标准曲线等。